Nowe strategie w terapii raka prostaty – przełomowe połączenie doxazosyny i abirateronu

Czy nowe strategie terapeutyczne rewolucjonizują walkę z rakiem prostaty?

Rak prostaty stanowi główną przyczynę zachorowań i zgonów wśród mężczyzn na całym świecie, zajmując piąte miejsce wśród najczęstszych nowotworów z 1,6 milionem nowych przypadków rocznie i 366 000 zgonów przypisywanych temu nowotworowi w 2018 roku. W 2023 roku rak prostaty był drugą najczęstszą przyczyną zgonów nowotworowych wśród mężczyzn w Stanach Zjednoczonych, a według danych GLOBOCAN z 2020 roku, był najczęściej diagnozowanym nowotworem w 112 krajach. Rak prostaty dotyka mężczyzn różnych grup etnicznych i ras, z wyższymi wskaźnikami śmiertelności w grupach o niższym statusie socjoekonomicznym. Leczenie raka prostaty staje się szczególnie trudne, gdy choroba ulega przerzutom i staje się oporna na terapię kastracyjną, co określa się jako przerzutowy oporny na kastrację rak prostaty (mCRPC).

Niedawne badania kliniczne wykazały, że nowe terapie poprawiają wskaźniki przeżywalności pacjentów z mCRPC. Nowatorska terapia hormonalna z zastosowaniem abirateronu wykazała znaczące korzyści u pacjentów z mCRPC. U mężczyzn z miejscowo zaawansowanym lub przerzutowym rakiem prostaty, połączenie terapii deprywacji androgenów (ADT) z abirateronem i prednizolonem skutkowało znacząco wyższą ogólną przeżywalnością i dłuższymi okresami bez progresji choroby w porównaniu do samej ADT. Wcześniejsze badanie wykazało, że pacjenci leczeni abirateronem po wcześniejszym leczeniu chemioterapią docatësem wykazali poprawę ogólnej przeżywalności. Jednym z wyzwań pozostaje jednak wysoki koszt abirateronu oraz jego skutki uboczne.

Problemy związane z rakiem prostaty nie ograniczają się jedynie do jego złośliwości; objawy związane z chorobą, w tym objawy ze strony dolnych dróg moczowych (LUTS), są powszechne u pacjentów z rakiem prostaty, przy czym 39% doświadcza umiarkowanych objawów, a 11% doświadcza ciężkich objawów. Badania nad pacjentami z łagodnym rozrostem prostaty (BPH) leczonymi alfa-blokerami, takimi jak doxazosyna, wykazały obecność apoptozy w analizach histopatologicznych. Oprócz zastosowania w leczeniu LUTS, zdolność doxazosyny do indukowania apoptozy w komórkach raka prostaty czyni ją obiecującą opcją terapeutyczną.

Kombinacja doxazosyny i abirateronu pozostaje stosunkowo mało zbadana, jednak może oferować dodatkowe korzyści terapeutyczne w leczeniu raka prostaty. Komórki mCRPC PC3, charakteryzujące się jako agresywne, niezależne od androgenów komórki raka prostaty, są często wykorzystywane w badaniach nad progresją tej choroby. Komórki te, pochodzące pierwotnie z raka prostaty z przerzutami do kości, zawierają subpopulację komórek podobnych do komórek macierzystych, które odgrywają kluczową rolę we wzroście guza. Zastosowanie leczenia skojarzonego z abirateronem w tym badaniu miało na celu obserwację efektu apoptozy wywołanej przez doxazosynę jako pojedynczy lek oraz w połączeniu z abirateronem, który jest standardową terapią ADT w leczeniu mCRPC. Model in vitro został wykorzystany w tym wstępnym badaniu w celu zebrania początkowych danych jako podstawy przed przejściem do bardziej złożonych badań, w tym modeli in vivo.

Jak zaprojektowano badanie in vitro w modelu mCRPC PC3?

Celem niniejszego badania była ocena potencjału doxazosyny jako terapii uzupełniającej w leczeniu raka prostaty. Oprócz jej roli w łagodzeniu objawów LUTS i służeniu jako dodatkowe leczenie dla pacjentów z rakiem prostaty, badanie to analizuje również skuteczność łączenia doxazosyny z abirateronem w hamowaniu wzrostu komórek mCRPC PC3.

W przeprowadzonym badaniu in vitro wykorzystano linię komórkową raka prostaty mCRPC PC3. Hodowle komórek raka prostaty zostały zakupione z American Type Culture Collection (ATCC), USA, z wykorzystaniem linii komórkowych mCRPC PC3. Komórki mCRPC PC3 umieszczono w ciekłym azocie i rozmrożono za pomocą suchego lodu w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez dwie minuty. Następnie komórki umieszczono w probówce wirówkowej i wirowano przez pięć minut przy 125×g. Komórki mCRPC PC3 przeniesiono do naczyń hodowlanych zawierających kompletne medium wzrostowe i inkubowano przez 15 minut, aż pH ustabilizowało się na poziomie 7,6. Naczynia hodowlane inkubowano w temperaturze 37°C i 5% CO₂ w atmosferze powietrza. Subkultura rozpoczęła się, gdy komórki osiągnęły 70% gęstości komórkowej. Kompletne medium składało się z medium F-12K uzupełnionego surowicą płodową bydlęcą do końcowego stężenia 10%, wraz z dodatkowymi suplementami, w tym dimetylosulfotlenkiem, buforem fosforanowym i penicyliną/streptomycyną.

Badanie obejmowało jedną grupę kontrolną i trzy grupy eksperymentalne, które były poddawane działaniu doxazosyny, abirateronu lub kombinacji doxazosyny i abirateronu przez 72 godziny. Każda grupa była replikowana sześciokrotnie, zgodnie z formułą Federera dla minimalnej wielkości próby: (n – 1)(t – 1)≥15. Po 72-godzinnym okresie ekspozycji, wskaźnik apoptozy każdej grupy mierzono za pomocą cytometrii przepływowej (FACS).

Przeprowadzono test żywotności komórek w celu oceny zdolności doxazosyny do zmniejszania proliferacji komórek mCRPC PC3 i określenia jej wartości IC₅₀. Doxazosynę i abirateron zakupiono w Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japonia). Wartość IC₅₀ abirateronu wynosiła 66,9 μM, uzyskana z wcześniejszego badania z komórkami mCRPC PC3 od tego samego dostawcy. Komórki mCRPC PC3 wysiano w gęstości 3000-4000 na dołek w płytkach 96-dołkowych i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze komórkowym z 5% CO₂ przez 24 godziny. Doxazosynę podawano na płytki komórkowe w kompletnym medium przez 72 godziny w stężeniach, które wahały się od 0,1 do 100 μM, inkubowanych w temperaturze 37°C, 5% CO₂ i 100% wilgotności. Komórki następnie inkubowano przez dwie godziny w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przy użyciu testu żywotności zestawu do liczenia komórek-8 (CCK-8) (50 μL CCK-8 na ml medium hodowlanego), test wykonano z zachowaniem środków ostrożności dotyczących sterylności. Względną absorbancję komórek mierzono przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek RT-2100C (Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd Shenzen, Chiny). Analizę żywotności komórek i pomiar IC₅₀ powtarzano sześciokrotnie.

Analizę apoptozy przeprowadzono na czterech grupach: jednej grupie kontrolnej i trzech grupach eksperymentalnych (doxazosyna, abirateron i kombinacja doxazosyny i abirateronu). Komórki mCRPC PC3 poddano dwukrotnemu przemyciu buforem barwnika komórkowego BioLegend (Elabsciences, Houston, TX, USA) przed ponownym zawieszeniem w buforze wiążącym aneksynę V (Elabsciences, Houston, TX, USA) w stężeniu 1,0 × 10⁶ komórek/ml. Próbkę 100 μL zawiesiny komórkowej przeniesiono do probówki testowej o pojemności 5 ml, a następnie dodano 5 μL izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) aneksyny V (Elabsciences, Houston, TX, USA) i 10 μL roztworu jodku propidyny (Elabsciences, Houston, TX, USA). Inkubację probówek przeprowadzono w ciemności w temperaturze pokojowej (25°C) przez 15 minut, a następnie dodano 400 μL buforu wiążącego aneksynę V do każdej probówki.

Analizę FACS, z wykorzystaniem linii lasera argonowo-jonowego 488 nm i detekcji przez kanał PE/Texas Red® z filtrem pasmowym 610/10, zastosowano do kwantyfikacji komórek apoptotycznych. Przeanalizowano łącznie 10 000 komórek na replikację. Następnie zastosowano bramkowanie w celu rozróżnienia komórek i wykluczenia szczątków. Rozproszenie do przodu (FSC) zastosowano do reprezentowania rozmiaru komórki, podczas gdy rozproszenie boczne (SSC) reprezentowało ziarnistość komórkową. Analizę apoptozy komórek powtarzano sześciokrotnie.

Jakie wyniki uzyskano z analizy komórek mCRPC PC3?

W analizie kwadrant bramkowania sklasyfikowano według czterech kryteriów: po pierwsze, komórki aneksyna V ujemne i jodek propidyny ujemne reprezentują normalną populację komórek. Po drugie, komórki aneksyna V dodatnie i jodek propidyny ujemne reprezentują komórki mCRPC PC3 we wczesnym stadium apoptozy. Po trzecie, komórki aneksyna V dodatnie i jodek propidyny dodatnie reprezentują komórki mCRPC PC3 w późnej apoptozie. Po czwarte, komórki aneksyna V ujemne i jodek propidyny dodatnie reprezentują komórki mCRPC PC3 ulegające nekrozie. W tym badaniu policzono całkowitą średnią we wczesnej i późnej apoptozie. Emitowaną fluorescencję komórek mierzono za pomocą Becton Dickinson (BD) FACSCalibur (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA).

Analiza żywotności komórek wykazała, że leczenie komórek mCRPC PC3 rosnącymi dawkami doxazosyny (1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 15 μM i 31 μM) dało wartości absorbancji między 0,335 a.u. a 0,403 a.u. IC₅₀ dla żywotności określono dzieląc względną wartość absorbancji każdego leczenia przez wartość absorbancji grupy kontrolnej. Wyniki pokazały, że doxazosyna zmniejszała żywotność komórek mCRPC PC3 w zależności od dawki, z wartością R² wynoszącą 0,9853. Wartość IC₅₀ doxazosyny dla komórek mCRPC PC3 określono na 25,42±1,42 μM (średnia ± błąd standardowy).

Badanie wykorzystało FACS do oceny odsetka komórek przechodzących apoptozę po leczeniu. Komórki mCRPC PC3 zostały sklasyfikowane do czterech kwadrantów na podstawie sygnałów emisji komórek. Wczesna apoptoza została zidentyfikowana w dolnym prawym kwadrancie, a późna apoptoza w górnym prawym kwadrancie.

Dane z tego badania wykazały normalny rozkład, a analiza jednoczynnikowa ANOVA wykazała istotną różnicę w całkowitej średniej apoptozie między grupami (p=0,001). Wykres słupkowy pokazuje różnice w całkowitej średniej apoptozie między grupami. Analiza post-hoc z wykorzystaniem testu Tukeya HSD wykazała, że wszystkie trzy grupy – abirateron, doxazosyna oraz kombinacja doxazosyny i abirateronu – wykazały wyższą całkowitą apoptozę w porównaniu do grupy kontrolnej. Co interesujące, kombinacja doxazosyny i abirateronu skutkowała większą całkowitą średnią apoptozą niż abirateron jako pojedynczy lek (p=0,029). W konsekwencji, gdy porównano kombinację doxazosyny i abirateronu z samą doxazosyną, kombinacja wykazała wyższą całkowitą apoptozę (p=0,001). Odkrycia te podkreślają znaczące różnice w aktywności apoptotycznej między grupami leczenia, przy czym kombinacja abirateronu i doxazosyny konsekwentnie wykazywała najsilniejszy efekt.

Czy wyniki badania potwierdzają skuteczność doxazosyny?

W badaniu potwierdzono, że IC₅₀ doxazosyny dla komórek mCRPC PC3 wynosi 25,42±1,42 μM, co potwierdza jej zdolność do zmniejszania żywotności komórek mCRPC PC3. Jednak raportowane wartości IC₅₀ dla doxazosyny są różne. Badania nad IC₅₀ doxazosyny w komórkach PC3 wykazały wartość 23,3 μM, podczas gdy w komórkach LNCaP zaobserwowano wartość 17,2 μM. Wcześniejsze badania nad doxazosyną z wykorzystaniem testu MTT wykazały wartości IC₅₀ wynoszące 38,60 μM w komórkach PC3, 37,44 μM w komórkach DU-145 i 28,11 μM w komórkach LNCaP. Różnice te są prawdopodobnie spowodowane różnicami w charakterystyce komórek, czasie trwania leczenia, czasie inkubacji i technikach pomiarowych.

Badanie to oceniło również apoptozę w komórkach mCRPC PC3 leczonych doxazosyną, abirateronem i ich kombinacją za pomocą FACS. Doxazosyna wykazała znacząco wyższy średni procent całkowitego efektu apoptotycznego w porównaniu do grupy kontrolnej. Obserwacje za pomocą FACS wykazały, że doxazosyna indukowała aktywność apoptotyczną, która była widoczna w górnym prawym kwadrancie wykresu jako późna apoptoza i w dolnym prawym kwadrancie jako wczesna apoptoza. Wyniki te były zgodne z wcześniejszym badaniem, które również wykorzystywało barwienie aneksyną V i PI, które wykazało znaczący wzrost apoptozy przy stężeniu doxazosyny wynoszącym 25 μM. Ponadto cytotoksyczność wywołana przez doxazosynę w komórkach mCRPC PC3 jest głównie pośredniczona przez apoptozę, a nie nekrozę.

Dalsze dowody na mechanizm apoptotyczny doxazosyny uzyskano poprzez barwienie terminalną transferazą deoksynukleotydylową znakowaną dUTP (TUNEL), obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym z zieloną fluorescencją (FITC) w jądrach, wskazującą na aktywność apoptotyczną. Inne barwienie TUNEL przeprowadzono w celu potwierdzenia obecności apoptozy w komórkach mCRPC PC3, wraz z dodatkowymi dowodami z zwiększonej ekspresji mRNA klusteryny po leczeniu doxazosyną, białka produkowanego w celu ochrony komórek przed apoptozą.

Jak działają molekularne szlaki w odpowiedzi na terapię?

Godnym uwagi odkryciem z tego badania była zwiększona apoptoza obserwowana przy kombinacji doxazosyny i abirateronu w porównaniu do samego abirateronu. Wskazuje to, że kombinacja doxazosyny, która celuje w apoptozę poprzez szlak TGF-β1, oraz abirateronu, który hamuje sygnalizację androgenową, może wywierać synergistyczny efekt w promowaniu śmierci komórek nowotworowych. Aktywność apoptotyczna komórek mCRPC PC3 z abirateronem była również wcześniej badana w połączeniu z sylodosyną i metforminą oraz dekursynolem angelat. Abirateron hamuje enzym CYP17A1, który jest niezbędny do produkcji steroidów, tym samym zmniejszając poziom androgenów zarówno w nadnerczach, jak i tkankach guza prostaty. Abirateron modyfikuje również molekularne szlaki apoptozy, zwiększając aktywność białek pro-apoptotycznych, takich jak kaspaza-3, jednocześnie zmniejszając poziom białek anty-apoptotycznych, jak BCL-2. Ponadto abirateron może hamować autofagię, prowadząc do zmniejszonej żywotności komórek i zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G2/M.

Wcześniejsze badania nad lekami opartymi na chinazolinie, w tym doxazosyną i terazosyną, ujawniły znaczne zmniejszenie żywotności linii komórkowych raka prostaty, w szczególności mCRPC PC3 i DU-145, a także w pierwotnych hodowlach ludzkich komórek mięśni gładkich prostaty (SMC-1), gdy doxazosyna i terazosyna były stosowane w stężeniach przekraczających 10 μM. Tego zmniejszenia żywotności nie zaobserwowano w przypadku alfa-blokerów bez struktury pierścienia chinazoliny, w tym tamsulosyny. Ponadto eksperyment z komórkami mCRPC PC3 i LNCaP leczonymi różnymi stężeniami (0,01-100 μM) alfa-blokerów (prazosyna, doxazosyna, tamsulosyna i alfuzosyna) wykazał zmniejszenie żywotności komórek z prazosyną i doxazosyną, które zawierają strukturę pierścienia chinazoliny.

Dalsze badania właściwości przeciwnowotworowych pochodnych chinazoliny obejmowały efekty doxazosyny na różne linie komórek nowotworowych, takie jak komórki raka piersi MCF-7, komórki raka okrężnicy SW-480 i komórki raka pęcherza HTB, wszystkie wykazujące zmniejszoną żywotność. Doxazosyna wykazała również aktywność przeciwnowotworową w raku nerkowokomórkowym, raku trzustki i glejakach, a także w komórkach raka szyjki macicy HeLa, komórkach raka wątrobowokomórkowego HepG-2 i komórkach MCF-7.

Jakie ograniczenia wiążą się z uzyskanymi wynikami?

Niniejsze badanie ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, projekt badania opiera się na modelu in vitro, który nie jest w stanie zastąpić złożoności i nie może w pełni odtworzyć warunków fizjologicznych modelu in vivo. Po drugie, badacze nie byli w stanie dokładnie zbadać szlaków zaangażowanych w apoptozę leżącą u podstaw wyników tego badania. Po trzecie, badanie wykorzystało tylko jedną linię komórkową, która nie reprezentuje adekwatnie rzeczywistych warunków fizjologicznych, ograniczając bezpośrednią stosowalność wyników. Ograniczenia te zostaną uwzględnione w przyszłych badaniach.

Jakie perspektywy daje terapia uzupełniająca oparta na doxazosynie?

Badanie to podkreśla potencjał doxazosyny jako uzupełniającego leczenia mCRPC, pokazując jej efekty indukujące apoptozę w komórkach mCRPC PC3. Staje się ona leczeniem adiuwantowym, które może być podawane pacjentom z rakiem prostaty oprócz leków chemioterapeutycznych. Kombinacja doxazosyny z abirateronem była bardziej skuteczna w indukowaniu apoptozy niż sam abirateron. Chociaż te wyniki in vitro są obiecujące, dalsze badania in vivo i długoterminowe oceny są niezbędne do potwierdzenia bezpieczeństwa i skuteczności doxazosyny w leczeniu mCRPC. Badanie to stanowi podstawę dla przyszłych badań nad doxazosyną jako skuteczną terapią uzupełniającą w celu poprawy wyników u pacjentów z mCRPC.

W podsumowaniu, badanie to potwierdza skuteczność doxazosyny jako terapii uzupełniającej w leczeniu mCRPC, co jest widoczne w jej zdolności do zmniejszania żywotności komórek i indukcji apoptozy w komórkach mCRPC PC3 w porównaniu z grupą kontrolną. Kombinacja doxazosyny i abirateronu wykazała zwiększoną apoptozę w komórkach mCRPC PC3 w porównaniu z leczeniem samym abirateronem lub samą doxazosyną. Chociaż wyniki in vitro są obiecujące, konieczne są dalsze badania in vivo w celu walidacji przeciwnowotworowego działania doxazosyny, potwierdzenia jej długoterminowego bezpieczeństwa i oceny jej potencjału w terapiach kombinowanych. Badanie to kładzie podwaliny pod przyszłe badania nad rolą doxazosyny w zwiększaniu skuteczności terapii CRPC.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na ocenie skuteczności doxazosyny jako terapii uzupełniającej w leczeniu opornego na kastrację raka prostaty (mCRPC). W przeprowadzonych testach in vitro na linii komórkowej mCRPC PC3 wykazano, że doxazosyna skutecznie zmniejsza żywotność komórek nowotworowych i indukuje apoptozę. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kombinacja doxazosyny z abirateronem wykazała znacząco wyższą skuteczność w indukowaniu apoptozy komórek nowotworowych w porównaniu do monoterapii każdym z tych leków. Wartość IC₅₀ dla doxazosyny została określona na poziomie 25,42±1,42 μM, co potwierdza jej potencjał terapeutyczny. Mimo obiecujących wyników, badacze podkreślają konieczność przeprowadzenia dalszych badań in vivo w celu potwierdzenia skuteczności i bezpieczeństwa tej terapii kombinowanej w warunkach klinicznych.